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探針法熒光定量PCR試劑盒存放與使用注意

更新時間：2023-09-09　點擊量：867
　　探針法熒光定量PCR試劑盒的存放與使用需特別注意溫度控制、避免污染和正確操作等。該試劑盒主要用于病毒檢測和研究實驗中對特定基因表達量的精確測定。由于其靈敏度高，任何小的操作失誤都可能影響實驗結果的準確性。
　　首先，在使用前要確保總RNA的完整性和純度。RNA的質量直接影響到cDNA合成的效率和后續PCR的結果。通過使用NanoDrop 2000或Agilent 2100 Bioanalyzer系統可以檢測RNA質量，而甲醛膠電泳則是一種更為傳統但同樣有效的方法。這些步驟需要在無核酸酶的環境中進行，以防止RNA降解。
　　其次，是優化cDNA的合成。實驗室通常采用不同的反轉錄方法來獲取cDNA，但其濃度往往需要通過預實驗確定最佳稀釋倍數。這可以通過使用管家基因進行常規RT-PCR來實現，以確保cDNA的量適合熒光定量PCR的要求。
　　在使用探針法熒光定量PCR試劑盒時，應嚴格遵循制造商提供的說明書，并注意以下幾點：
　　1.溫度控制：
　　試劑盒應在-20℃下保存，使用前解凍并立即放回冷凍保存。
　　所有反應體系配制應在冰上進行，以保持酶和其他試劑的活性。
　　2.避免污染：
　　所有操作都應在超凈工作臺內進行，工作臺需紫外照射至少15分鐘以消毒。
　　實驗過程中必須佩戴無菌手套和口罩，盡量避免交談，以防模板污染。
　　3.正確操作：
　　在加樣過程中，建議先加入模板和其他反應組分，最后加入Taq聚合酶，以減少酶在室溫下的暴露時間。
　　使用專用的qPCR光學管，以避免使用普通PCR管可能帶來的熒光信號干擾。
　　完成加樣后，建議通過瞬離將反應液離至管底，并消除溶液中的氣泡，因為氣泡會干擾熒光檢測且降低酶活性，從而降低擴增效率。