通用PCR試劑盒適用于各種RNA制品的反轉錄反應以及隨后的PCR擴增。通用PCR試劑盒它采用M-MLV進行反轉錄反應,能夠獲得較長的反轉錄產物。
因快速靈敏檢測通用具有重要意義,本產品就是為此目的根據PCR原理開發的試劑盒。
通用PCR試劑盒具有下列特點:
1.即開即用,用戶只需要提供DNA模板。
2.引物經過精心優化,專一性強,只擴增通用,與其他植物沒有交叉反應。
3.提供陽性對照,便于區分假陰性樣品。
4.PCRmix中含上樣染料,PCR后可以直接上樣電泳。
5.本試劑盒足夠做40μL體系的PCR50次,但只能用于科研。
通用PCR試劑盒PCR常見的問題及原因:
一、產生彌散條帶:
1、在PCR反應體系中一鏈產物的含量過高
2、減少引物的用量
3、優化PCR反應條件/減少PCR的循環次數
4、在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時,其產生的寡核苷酸片段會產生非特異性擴增,一般會顯示為彌散背景。
3、由于mRNA剪切方式的不同,根據選擇引物的不同將導致產生不同的RT-PCR結果。
二、產生非特異性條帶:
1、用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶,則需要用DNaseI重新處理樣品。
2、在PCR反應中,非特異的起始擴增將導致產生非特異性結果。在低于引物Tm2至5℃的溫度下進行退火,降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產生。
三、產生大分子量的彌散條帶:
1、大多數情況下是由于退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產生的
2、對于長片段的PCR,建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)
四、在無反轉錄酶的情況下,對照RNA獲得擴增結果。