FITC-Annexin V/PI 細胞凋亡試劑盒 

產品貨(huo)號(hao)：F6012L 

產品(pin)規格：100T 

儲存條(tiao)件(jian)：

4℃避光冷藏(zang)，請勿凍存(cun)。有效(xiao)期見外包裝。

光譜特性：

FITC-Annexin V: Ex/Em = 494/518 nm 

PI: Ex/Em = 535/617 nm (with DNA)

產品介紹(shao)：

FITC-Annexin V/PI凋(diao)亡(wang)(wang)試劑(ji)盒提供了一(yi)種快速(su)簡便的(de)方法，通過標(biao)記早期(qi)凋(diao)亡(wang)(wang)細胞(bao)（綠色(se)）和壞死或晚期(qi)凋(diao)亡(wang)(wang)的(de)細胞(bao) （紅色）檢(jian)測(ce)細胞凋亡(wang)水平。產品(pin)可以使用流式(shi)細胞儀或(huo)其它熒光檢(jian)測(ce)設備進行檢(jian)測(ce)。 

Annexin V（膜聯(lian)蛋白-V）是一(yi)種分子量為 35-36KD 的 Ca2+依賴性磷脂結合(he)蛋白，可于磷脂酰（PS）選擇性(xing)結合(he)。 磷脂酰(xian)（PS）主要(yao)分布在(zai)細(xi)胞(bao)膜內(nei)側(ce)，即與細(xi)胞(bao)漿相鄰的一側(ce)。在(zai)細(xi)胞(bao)發生(sheng)凋亡(wang)的早期(qi)，不同類型的細(xi)胞(bao)都會(hui)把磷脂 酰外翻(fan)到(dao)細(xi)胞表(biao)面，暴露(lu)在細(xi)胞外環境中(zhong)。此(ci)時，使用(yong)綠色熒光探針 FITC 標記(ji)的 Annexin V，即 FITC - Annexin V， 與外翻的磷脂酰(xian)（PS）結合，就可用流式(shi)細胞(bao)儀或熒光顯微鏡直(zhi)接檢測到磷脂(zhi)酰(xian)的(de)外翻這一(yi)細胞(bao)凋亡(wang)的(de)重要特 征。對于壞(huai)死或晚期凋亡的細胞，由于細胞完整性已(yi)經被破壞(huai)，FITC - Annexin V 則(ze)可以進(jin)入胞漿與處(chu)于磷(lin)脂(zhi)層內側的 PS 結合，從而也使壞(huai)死細胞呈(cheng)現綠色熒光。 

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結(jie)合染(ran)料，它可以染(ran)色壞死細(xi)(xi)(xi)胞或凋亡晚(wan)期(qi)喪失細(xi)(xi)(xi)胞膜完整(zheng)性的(de)細(xi)(xi)(xi)胞的(de)細(xi)(xi)(xi) 胞(bao)核。PI 可以由 488、532 或 546 nm 的激光激發，呈現紅色熒光。

使用方法(fa)：

1. 實驗設(she)計(ji)：

空白管：陰性對照組細胞，不加FITC-Annexin V/PI。用于調節電壓。

單染管：陽性對照組細胞，只加FITC-Annexin V/只加PI。用于調節補償。

檢測管：處理的細胞，加FITC-Annexin V/PI。用空白管和單染管調節好電壓補償后，獲得所需要的流式數據。 

2. 收(shou)集細(xi)胞(bao)：

(1) 對于懸浮細胞：

a. 在進行完細胞凋亡刺激后，1000 rpm離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。 注：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細胞的作用，可以保證后續 FITC-Annexin V的結合。 

b. 取5×104 -1×105個重懸的細胞，1000 rpm離心5 min，棄上清，加入100 µL 1×Annexin V 結合緩沖液輕輕重懸細胞。 

c. 加入5 µL FITC-Annexin V，輕輕混勻。 

d. 加入5 µL PI染色液，輕輕混勻。 

e. 室溫 ( 20-25oC ) 避光孵育10 - 15 min。可以使用鋁箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。

(2) 對于貼壁細(xi)胞：

a. 把細胞培養液吸出至一合適離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量細胞消化液(不含EDTA)消化細胞。室溫孵育 至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除細胞消化液。需避免的過度消化。 注：對于貼壁細胞，消化步驟很關鍵。消化時間如果過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷， 從而導致細胞壞死的假陽性；消化時間如果過長，同樣易造成細胞膜損傷而出現細胞壞死的假陽性，甚至會影響細胞膜上磷 脂酰與FITC-Annexin V的結合從而干擾對于細胞凋亡的檢測。 

b. 加入上步中收集的細胞培養液，把細胞輕輕吹打下來，轉移到離心管內，1000 rpm離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS 輕輕重懸細胞并計數。 注：加入上步中的細胞培養液非常重要，一方面可以收集已經懸浮的發生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養液中的血清 可以有效抑制或中和殘留的。殘留的會消化并降解后續加入的 FITC-Annexin V，導致染色失敗。 

c. 取5×104 -1×105個重懸的細胞，1000 rpm離心5 min，棄上清，加入100 µL 1×Annexin V 結合緩沖液輕輕重懸細胞。 

d. 加入5 µL FITC-Annexin V，輕輕混勻。 

e. 加入5 µL PI染色液，輕輕混勻。 

f. 室溫 (20-25oC )避光孵育10 - 15 min。可以使用鋁箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。 

3. 結果分析：

(1) 流(liu)式細(xi)胞(bao)儀(yi)檢(jian)測：

a. 孵育完成后，可直接加(jia)入400 μL 1×Annexin V 結合(he)緩沖(chong)液(ye)重懸細(xi)胞，立即上(shang)機檢(jian)測， FITC-Annexin V 由488 nm激光(guang)激 發(fa)，檢(jian)測熒光(guang)發(fa)射光(guang)譜(pu)在530 nm處(chu)（FITC 通道），PI通道發(fa)射光(guang)譜(pu)約在617 nm處(chu)。

b. 在雙(shuang)變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限(xian)(xian)(xian)顯(xian)示活細胞，為(wei)（FITC-Annexin V-/PI-）；右下象限(xian)(xian)(xian)為(wei)早期(qi)凋亡(wang)細胞，為(wei)（FITCAnnexin V+/PI-）；右上象限(xian)(xian)(xian)是壞死與晚期(qi)凋亡(wang)細胞，為(wei)（FITC-Annexin V+/PI+）；左上象限(xian)(xian)(xian)顯(xian)示裸核細胞，為(wei)（FITC-Annexin  V-/PI+)。 

(2) 熒(ying)光顯微鏡(jing)檢測：

a. 1000 rpm離心(xin)5 min，收集(ji)細胞，用400 µL 1×Annexin V 結合緩(huan)沖液輕(qing)輕(qing)重(zhong)懸(xuan)細胞。將細胞移至96孔板中沉降片刻或進行(xing) 細胞涂(tu)片后，置(zhi)于(yu)熒光顯微鏡下觀察(cha)。 

b. FITC-Annexin V 可(ke)用(yong) FITC適(shi)用(yong)的濾光(guang)片，PI可(ke)用(yong) Cy3 或者 Texas適(shi)用(yong)的濾光(guang)片。

注(zhu)意(yi)事項：

1. 使用前請將產品瞬時離心至管底，再進行后續實驗。 

2. 為降低細胞凋亡進程，孵育過程可在冰上操作，但孵育時間至少延長至 30 min。 

3. 由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后 1 h 之內進行分析。 

4. 對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。 處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜 的損傷，PI 攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰與 FITC-Annexin V 的結 合。消化時將鋪滿孔板底后，輕搖時與細胞充分接觸，然后倒掉大部分，利用剩余的少量再消化一段時間， 待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用 EDTA，EDTA 會影響 Annexin V 與 PS 的結合。 

5. 貼壁細胞用消化后，建議在培養條件和培養基中恢復約 30 min 后染色，避免假陽性。 

6. 為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的 Tip 頭套上小的 Tip 頭吸液。 

7. 染料的使用濃度由具體實驗要求確定。 

8. 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。 

9. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。