Minerva Super Fusion Cloning Kit（無縫克隆試劑盒） 

產品貨號： M2026L 

產(chan)品規格：10 μL× 50T 

儲存條件：-20℃保存，有效(xiao)期見外包裝。

產品(pin)介紹(shao)：無縫克隆是一種簡單、快速并且高效的 DNA 定向克隆技術，可將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點。 Minerva Super Fusion Cloning Mix 通過識別 DNA 片段和線 性化載體末端的 15-25 bp 同源序列，50℃反應 15-60 min 即可將 DNA 片段和線性化載體高效精確地融合在一起， 完成定向克隆，且克隆陽性率可達 95%以上。 

產品特點：

1. 簡單、快速、高效，可將插入片段克隆至任意線性載體 的任意位點； 

2. 不依賴于連接酶，無載體自連，陽性率可達 95%以上； 

3. 無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點； 

4. 一次反應可完成單至多個片段重組。

使用方法：

一． 制備線性化克隆(long)載體(ti)

選(xuan)擇合適的(de)克隆(long)位點，對載(zai)體(ti)(ti)進行線(xian)性(xing)化(hua)，線(xian)性(xing)化(hua)載(zai)體(ti)(ti) 可(ke)以通過酶切或者反向 PCR 擴增完成(cheng)。 

（1）酶切(qie)制備 雙酶切：線性(xing)(xing)化(hua)，轉化(hua)背景（假陽性(xing)(xing)克隆）低； 單酶切：線性(xing)(xing)化(hua)程度差(cha)，可通過適當延長酶切時間來(lai)減 少環(huan)狀質(zhi)粒的殘留。 注：（1）雙酶(mei)切無需去(qu)磷酸(suan)化，單酶(mei)切需要去(qu)磷酸(suan)化； （2）酶(mei)切(qie)(qie)完(wan)成后，應將快速內切(qie)(qie)酶(mei)失活或對目的(de)產物(wu)純(chun)化后再用于重 組(zu)反應。 （2）反(fan)向 PCR 擴增制(zhi)備 載體質粒(li) DNA 為模板，克隆位點為分(fen)界點，設計一對 反向(xiang)引(yin)物，推薦(jian)使用高保真 PCR Mix 進(jin)行(xing)擴增(zeng)。

二． 設計插入 PCR 引(yin)物片段 PCR 引物的 5’端必須包含與其相鄰片(pian)段（插入片(pian)段或(huo) 載(zai)體）末端同源的 15~25 nt（推薦(jian) 18 nt）序列。假如載體 為粘性末(mo)端，且 3’端突出，則引物設計必(bi)須包含突出部分； 若(ruo) 5’端突出，則引物設(she)計可以包含突出部分，也可以不(bu)包含。 插(cha)入片(pian)段擴增引物： 5’—上(shang)游載體末(mo)端同(tong)源序列+酶切位點（可選）+基因特 異性正向擴增序(xu)列—3’ 3’—基因特異性反向擴增序列+酶切位點（可選）+下(xia)游(you) 載(zai)體(ti)末端同源(yuan)序(xu)列—5’

注(zhu)：盡(jin)量選擇無重復序(xu)列且 GC 含(han)量均勻的區域進行克隆(long)，當(dang)載體(ti)克隆(long) 位(wei)點上下游(you) 25 nt 區域內 GC 含量為(wei) 40~60%時，重組高

三． 插入片(pian)段的(de) PCR 擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng) 插入片(pian)段可用(yong)任意(yi) PCR 酶(mei) (Taq 酶(mei)或高保真酶(mei)) 擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)， 無需考慮產物末端有無 A 尾 (重組過程(cheng)中(zhong)將被去除， 在最 終質(zhi)粒(li)中(zhong)不會出現)。 建(jian)議使用(yong)高保真聚合酶(mei)進(jin)行擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)以減 少擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)突(tu)變的(de)發生。建(jian)議使用(yong)純化(hua)后的(de) PCR 產物進(jin)行無縫 克(ke)隆反(fan)應(ying)，若 PCR 產物經瓊脂糖(tang)凝膠電泳鑒定(ding)為特異性擴(kuo) 增(zeng)(zeng)(zeng)產物，可直接(jie)可用(yong)于無縫克(ke)隆反(fan)應(ying)，但加樣的(de)體積不宜超 過反(fan)應(ying)總體積的(de) 20% 。

四．無縫克隆反(fan)應：

1. 冰水浴中配制以下反應體(ti)系：1.最(zui)適載體(ti)用量(liang)(liang)（ng）= 0.02×載體(ti)堿基(ji)對數(shu)(shu)，即 0.03 pmol。 2 插(cha)(cha)入單片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)時，最(zui)適片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)用量(liang)(liang)（ng）= 0.04×片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)堿基(ji)對數(shu)(shu)；插(cha)(cha)入多(duo) 片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)時，每片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)量(liang)(liang)（ng）= 0.02×片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)堿基(ji)對數(shu)(shu)。 注：（1）如果(guo)插(cha)(cha)入的單片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)長(chang)度大于載體(ti)，那么(me)應互(hu)換載體(ti)與(yu)插(cha)(cha)入片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan) 用量(liang)(liang)； （2）如果(guo)插(cha)(cha)入的片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)長(chang)度小于 200 bp，那么(me)要使用 5 倍載體(ti)的用量(liang)(liang)； （3）如果(guo)按上述(shu)公式計算(suan)得(de)到的用量(liang)(liang)低于低/高于最(zui)高值，那么(me)建議 直接按低/最(zui)高用量(liang)(liang)使用； （4）載體(ti)或插(cha)(cha)入片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)過(guo)長(chang)，片(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)數(shu)(shu)量(liang)(liang)過(guo)多(duo)，均會降低陽性率。 體(ti)系配制完成(cheng)后，輕輕吹吸數(shu)(shu)次(ci)混(hun)勻各組分(fen)，避免(mian)產生 氣泡即可，切勿渦旋(xuan)。

2. 將(jiang)反應體(ti)系置(zhi)于 50℃，反應 15-60 min。 注(zhu)：（1）推薦使(shi)用溫控比較精準的儀(yi)器(qi)進(jin)行反應，如 PCR 儀(yi)，反應時(shi) 間不足或過長(chang)(chang)都會(hui)降(jiang)低(di)克隆(long)效率(lv)； （2）當載體(ti)骨架在(zai) 10 kb 以上(shang)或插(cha)入片段在(zai) 4 kb 以上(shang)時(shi)，建議延長(chang)(chang)反 應時(shi)間到(dao) 30~60 min； （3）50℃反應完成后(hou)，建議進(jin)行瞬時(shi)離(li)心，將(jiang)反應液收集至管底。 3. 將(jiang)反應液離(li)心管置(zhi)于冰水浴中冷卻(que)，直接進(jin)行轉化或儲 存于-20℃。 注(zhu)：-20℃儲存的重組產(chan)物，建議在(zai) 1 周內使(shi)用。 

五(wu)． 克隆產物轉化 在 100 μL 感受態細胞中加入 5-10 μL 反應液，輕柔吹 吸混勻，置于冰上 30 min。42℃熱激 45~60s，冰浴 5 min。 加入 500 μL SOC 或 LB 培養基，37℃振蕩培養 40-60 min （200 rpm）。將菌液均勻涂布在含相應抗生素的平板上，倒 置于 37℃培養箱培養過夜。 注：（1）不同感受態細胞最后的克隆陽性率會有所差別，推 薦使用轉化效率>108 cfu/μg 的感受態細胞； （2）PCR 產物與線性化載體的數量和純度決定了菌落數； （3）陽性對照平板通常生長大量白色單菌落，陰性對照平 板只生長很少的菌落。 

六． 陽性克隆(long)檢測(ce)菌落 PCR 鑒定：挑取單菌落置于 10 μL ddH2O 中混勻， 95℃裂解 10 min，取 1 μL 作模板，進行菌落 PCR 鑒定，推薦使用 UE 2×Taq PCR Master Mix（Green）（S2045）。 酶切鑒定：將單菌落接種到抗性培養基中培養過夜，提 取質粒進行酶切鑒定。

注意：（1）建議(yi)菌(jun)落(luo) PCR 時，至少使(shi)用(yong)一條通用(yong)引物，可有(you)效避免假(jia) 陽性(xing)結果； （2）必要時可進(jin)一步(bu)對陽性結果進(jin)行測序鑒定(ding)